自21世紀(jì)以來，關(guān)于干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用始終是國內(nèi)外科研領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。根據(jù)我國國家自然科學(xué)基金網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，每年批準(zhǔn)的干細(xì)胞相關(guān)的國自然課題數(shù)量從2009年開始直線上升，并在2016年達(dá)到（658個(gè)），近幾年則仍保持在平均每年500-600個(gè)的較高水平，可見干細(xì)胞研究的火熱。

與普通成體細(xì)胞不同的是，干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能的特性，這種特性讓干細(xì)胞在某些領(lǐng)域的研究具有其他細(xì)胞所不具備的優(yōu)勢。此外，近年來以干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究，加深了生物學(xué)家對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及表觀遺傳學(xué)調(diào)控等生命現(xiàn)象本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，也推動(dòng)了細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因、基因編輯等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)，干細(xì)胞技術(shù)也為一些難治性疾病的臨床治療提供了新的思路。

認(rèn)識(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）

在眾多干細(xì)胞中，MSC是研究和應(yīng)用廣泛的一類，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細(xì)胞。1968年德國科學(xué)家Frieden Stein在骨髓中*發(fā)現(xiàn)了MSC的存在，并成功在體外進(jìn)行培養(yǎng)；1999年P(guān)ittenger等*在體外成功將MSC誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，證實(shí)了MSC的多向分化潛能。2006年，細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）規(guī)范了MSC的定義標(biāo)準(zhǔn)：①可貼壁生長；②細(xì)胞表面表達(dá)特定的特異性標(biāo)記物；③具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的能力。

MSC在機(jī)體中含量雖然不多，例如骨髓中每1~10萬個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中僅有1個(gè)骨髓MSC，但這極小比例的MSC卻在生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要的作用。且MSC分布廣泛，截止到目前，科學(xué)家已在骨髓、脂肪、臍帶、牙髓、皮膚等多種組織中均發(fā)現(xiàn)MSC的存在。

MSC的臨床應(yīng)用

MSC的臨床應(yīng)用十分廣泛，主要集中在3個(gè)方面：①直接細(xì)胞移植治療；②作為一種理想的靶細(xì)胞用于基因治療；③作為生物組織工程的種子細(xì)胞。自2009年第1個(gè)適用于膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的干細(xì)胞藥物上市以來，截止到目前獲批準(zhǔn)上市的干細(xì)胞藥物已有14個(gè)，一半以上是MSC，主要集中在組織修復(fù)和自身免疫性疾病。而根據(jù)Clinical Trials（由美國FDA和NIH共同建立）的數(shù)據(jù)，目前有884項(xiàng)關(guān)于MSC的臨床研究正在進(jìn)行，其中處在Ⅲ期的臨床試驗(yàn)共50項(xiàng)，其中已完成的有16項(xiàng)，主要疾病種類包括克羅恩病、移植物抗宿主病、心梗、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷等。

但目前MSC的臨床應(yīng)用仍存在較多挑戰(zhàn)，雖然已經(jīng)明確一些MSC的適應(yīng)癥并觀察到不錯(cuò)的治療效果，但MSC發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制仍有許多環(huán)節(jié)不明確。另外在我國，還沒有建立統(tǒng)一的MSC制備標(biāo)準(zhǔn)，臨床轉(zhuǎn)化過程中存在較大風(fēng)險(xiǎn)。

MSC的培養(yǎng)與鑒定

相比于胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞，MSC具有易獲取、易體外培養(yǎng)、傳代穩(wěn)定性、低免疫原性等優(yōu)勢，在體外經(jīng)過多次傳代后仍具有多向分化和自我復(fù)制的潛能，且MSCs多來自于成年的組織，研究過程的道德和倫理學(xué)問題較小。

MSC的大小與形狀具有異質(zhì)性，即不同種屬或不同組織的MSC具有不同的生長形態(tài)，例如三極形、長梭形、小圓形、短梭形和扁平形態(tài)。幾乎所有的MSC都是貼壁生長，具有較強(qiáng)的貼壁能力，而MSC的原代分離也正是利用了MSC強(qiáng)貼壁的特性。例如，骨髓MSC的分離方法為：將從組織中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含有FBS的培養(yǎng)基中，1~2天后去除非貼壁細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞再培養(yǎng)2-3周即可獲得。此外也可采用免疫磁珠對(duì)MSC進(jìn)行分選，但這種方法成本較高。

對(duì)于MSC的鑒定，常采用的方式包括形態(tài)學(xué)鑒定，表面標(biāo)志物鑒定和多系分化潛能鑒定。MSC一般呈纖維細(xì)胞樣生長，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米長短不同的突起。MSC的細(xì)胞表面標(biāo)志物則常采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，不同組織來源的MSCs可共享相同的細(xì)胞表面標(biāo)記，如CD29和CD44。但目前我們對(duì)MSC表面分子標(biāo)志物的研究還不完善，已發(fā)現(xiàn)的表面標(biāo)志物也存在特異性不強(qiáng)的問題，為了讓我們更好地分離、培養(yǎng)和鑒定MSC，需進(jìn)一步不斷發(fā)現(xiàn)新的特異性標(biāo)志物。

影響MSC細(xì)胞生長的主要因素

相比于細(xì)胞系，干細(xì)胞對(duì)其生長條件要求更為苛刻，稍不注意可能就導(dǎo)致細(xì)胞生長速度過慢。那么在培養(yǎng)MSC過程中應(yīng)注意哪些影響因素呢？

1、血清。血清的質(zhì)量對(duì)MSC的擴(kuò)增起重要作用，優(yōu)質(zhì)的血清可保持MSC高增殖能力并維持分化潛能。

2、接種密度。傳代的密度過低會(huì)減弱細(xì)胞的自分泌和旁分泌作用，密度過高則有可能出現(xiàn)接觸抑制，從而導(dǎo)致生長緩慢。

3、細(xì)胞因子。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一些細(xì)胞因子有助于維持MSC的增殖和未分化狀態(tài)。

4、細(xì)胞消化時(shí)間過長，胰蛋白酶作用時(shí)間太長導(dǎo)致細(xì)胞貼壁和生長狀態(tài)較差。